ELISA 和其他正交样品测试，用于分析测定稀释线性、加标回收率和抗 HCP 抗体覆盖率，以及下游宿主细胞蛋白的鉴定可能会与您的产品一起净化。
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鉴定通过抗体亲和提取™ (AAE™) 和质谱 (MS) 检测细胞蛋白是确保 HCP ELISA 适合目的的非常有价值的策略。 MS 可用于鉴定潜在富集的搭便车蛋白、指导纯化工艺开发以及鉴定最终药物中的 HCP。
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演示含有目标分析物的样品的稀释线性是验证分析的特异性和准确性的关键实验给定方法。
将已知量的分析物加标并回收到各种样品类型中对于验证给定方法的准确性是必要的。在某些情况下，产物蛋白质产品配方缓冲液中的自身或某些成分可能会干扰检测 HCP 或其他污染物的检测能力。
使用 2D PAGE 或质谱法进行抗体亲和提取™ (AAE™) 进行抗 HCP 抗体覆盖度分析。
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常见问题解答如何执行加标和恢复研究？
在某些情况下，您的产品或产品配方缓冲液中的某些成分可能会干扰（正面或负面干扰）测定法检测 HCP 或其他杂质的能力。同样，纯化过程上游的样品也可能在其基质中含有可能干扰 ELISA 方法的物质。极端 pH 值、洗涤剂、有机溶剂、高蛋白质浓度和高缓冲盐浓度等因素是已知的干扰成分。由于这些原因，有必要通过普遍认可的实验程序（即 ICH 和 FDA 指南）来验证该检测是否会产生准确的结果。评估测定准确性和特异性的两个关键实验是
样品稀释线性度加标回收率我们推荐d 首先执行稀释线性以确定抗体过量和最小所需稀释度或 MRD，因为加标和回收率数据仅在 MRD 下才有意义。如果该试剂盒的最终用户确定存在显着的产物或基质干扰，则可能需要通过稀释或缓冲液交换等方法进一步处理样品，以使其成为更适合检测的缓冲液。用于制备试剂盒标准品的相同稀释剂是样品稀释或缓冲液交换的理想首选材料。在其他情况下，修改检测方案可以提高某些样品类型的准确性。对于每种待测试的样品类型，无论是最终产品还是过程中样品，您都应该证明该测定可以回收添加到样品基质中的 HCP 或其他杂质。这可以通过将试剂盒提供的最高标准品掺入您的样品类型中，然后在测定中进行测试来完成。使用大肠杆菌 HCP ELISA 试剂盒 F41以 0 为例，我们建议将 1 份 100ng/mL 标准品添加到 4 份样品中（例如，将 100μL 100ng/mL 标准品添加到 400μL 样品中），如表 1 所示。情况下为20ng/mL。还进行 1 份测定稀释剂（零标准）与 4 份样品的对照稀释，以确定加标前样品中内源性 HCP 的贡献。对加标和稀释的纯/阴性样品进行分析。添加回收率百分比是通过从加标样品中测得的总 HCP 中减去 HCP 的内源贡献来确定的。 Cygnus 建议可接受的回收率应在加标 HCP 的 80% 至 120% 范围内。下表显示了示例数据。如果您需要超过一种浓度的加标和回收率，我们建议最低加标水平应至少为测定定量限 (LOQ) 的 2 倍，并且在加标之前样品中内源 HCP 的贡献加标不得超过待测加标水平的两倍。这两个条件将确保更好的统计准确性。
表 1. 加标和回收率数据示例
什么是\"高剂量钩状效应”？< p>对于任何 ELISA 要想给出准确的结果，相对于被检测的分析物，必须有过量的抗体，包括捕获抗体和酶联抗体。只有在抗体过量的情况下，剂量反应曲线才会呈正斜率，并且测定可以提供准确的定量。随着分析浓度当抗体量开始超过抗体量时，剂量反应曲线将趋于平坦（平台期），并且随着进一步增加，剂量反应曲线可能会反常地变为负斜率，这种现象称为\"高剂量钩效应”。由于某些样品的分析物浓度可能超过抗体，因此有必要通过稀释线性分析来验证所有样品类型，以确定它们是否位于曲线的有效正倾斜区域或负倾斜钩区域未能测试钩子效应的潜力可能会导致严重低估真实杂质浓度！HCP ELISA 等多种抗原测定中的钩子效应问题可能更加复杂。 HCP 测定的剂量响应曲线应被视为所有 HCP 的累积剂量响应，每个 HCP 都有其自己的钩区，该钩区由针对该特定 HCP 的抗体浓度确定。我们实际上和根本上都是有限的取决于可用于 HCP ELISA 的抗体量。在 HCP 测定中，某些样品中某些 HCP 的浓度超过该特定 HCP 的抗体量的情况并不罕见。在这种情况下，未稀释样品的吸光度可能低于试剂盒中的最高标准，但这些样品将无法表现出可接受的稀释回收率/线性，如 HCP 浓度随着稀释度的增加而明显且显着增加所证明的那样。这种稀释线性的缺乏实际上是分析物子集超过其各自抗体的钩子效应的结果。纯化过程早期的样品最有可能遇到稀释线性差（胡克效应）的情况。然而，如果纯化过程对某些 HCP 具有选择性，那么下游和最终产品样品中也可能会出现这种情况。因此，稀释线性的建立是HC开发和验证中最关键的实验。P 测定。稀释线性研究是在一系列稀释度下进行的，以确定给定样品类型的\"最小所需稀释度”(MRD)。 MRD 是相关样品的稀释调整值和所有后续稀释保持基本恒定的第一个稀释。此类样品报告的 HCP 值是等于或大于既定 MRD 的稀释校正值。一旦为特定样品类型建立了 MRD，您的 SOP 应反映出该样品在检测前需要进行稀释。
下面的表 1 显示了样品在高浓度下未产生良好稀释线性的数据浓度，但通过进一步稀释，确定获得可接受的稀释线性的 MRD。在此示例中，我们得出结论，该过程中样品的 MRD 为 1:8，要报告的 HCP 浓度为 361ng/mL。一旦为特定样本类型建立了 MRD，您的 SOP 应反映该样品在检测前需要稀释。我们建议将可接受的稀释线性定义为\"双倍稀释之间变化不超过 80% 至 120% 的稀释校正分析物浓度”。由于测定范围低端的统计限制，您应避免考虑稀释数据，其中稀释校正前的测定值低于测定 LOQ 的两倍。可接受的稀释剂可能因检测而异，我们鼓励您向 Cygnus 的技术支持验证您的样品稀释剂是否可接受。一般来说，最好的稀释剂与制备试剂盒标准品所用的稀释剂相同。可以从 Cygnus 购买 100ml、500ml 或 1000ml 瓶装的检测专用稀释剂。
表 1 过程中样品的稀释线性数据示例：
尝试测量痕量污染物（例如 HCP）的测定通常在产品过量超过一百万倍的情况下，可能容易受到产品的分析干扰。同样，来自纯化过程中各个点的样品也可能会受到干扰。基质中含有会干扰 ELISA 方法的成分。干扰可能表现为错误增加或错误e 真实分析物水平降低。极端 pH 值、洗涤剂、有机溶剂、高产物蛋白浓度和高缓冲盐浓度等因素是已知的干扰成分。当分析物的水平远高于测定的定量限 (LOQ) 时，稀释样品通常是克服干扰的最简单方法。在其他情况下，将样品缓冲液更换为与测定兼容的缓冲液将解决问题。还可以操纵测定方案来克服某些类型的样品干扰。我们鼓励使用我们试剂盒的用户联系我们的技术服务部门，获取有关如何最好地解决样品干扰问题的建议。
评估产品和样品基质干扰的关键实验是稀释线性和加标和回收率。请参阅故障排除指南中的\"稀释线性不佳”和\"加标和回收率不佳”。
Western Blot 与 ELISA 的灵敏度和特异性有何区别？对于 lac在众多更好的方法中，蛋白质印迹已被监管机构接受为与 ELISA 正交的方法。一些公司已使用 WB 来推动早期工艺开发，并根据覆盖率分析来鉴定用于 ELISA 的抗 HCP 抗体。由于缺乏敏感性和特异性，WB 在确定给定抗体如何对与原料药共纯化的更有限的阵列和浓度的单个 HCP 进行定量反应时没有预测价值。因此，Cygnus 不再建议使用 2D WB。相反，我们开发了一种称为抗体亲和提取 (AAE) 的方法。 AAE 的灵敏度和特异性比 2D WB 高 100 倍以上，因此将为各个 HCP 提供更准确的覆盖范围指示。更重要的是，AAE 可用于确定最重要的 HCP（在纯化过程中持续存在的 HCP）的覆盖范围。请参阅我们网站上的 AAE 白皮书。
对于那些仍希望执行 WB c 的人考虑到其局限性，并且尽管可以使用 AAE，我们仍提供以下信息。纯化过程下游的样品通常含有低于蛋白质印迹灵敏度的 HCP。对于蛋白质印迹，您可以上样的总蛋白量有限，但仍能获得良好的 PAGE 分辨率。当您在纯化过程中加载最终产品或下游样品时，绝大多数蛋白质将是产品本身。例如，在微型凝胶上运行的 PAGE 的最大蛋白质上样量约为 10 µg/泳道。如果 HCP 污染为 100ppm（许多最终药品的典型水平），那么 10μg 药物中的总 HCP 含量将为 1ng。蛋白质印迹的灵敏度约为 1 ng/条带，理论上，如果 100 ppm 是单个 HCP 而不是几种不同 HCP 的混合物，则可以检测低至 100 ppm 的 HCP 污染。对于大多数纯化过程，有几种 HCP 会污染最终产品。因为由于每种 HCP 相对于产品的浓度非常低，因此下游和最终产品样品的蛋白质印迹几乎总是呈阴性。 ELISA 表明药物产品的干扰较少，且灵敏度比 Western blot 低 100 倍以上。因此，ELISA 通常可以检测到低于 1ppm 的总 HCP 污染。还有许多其他根本原因导致蛋白质印迹的灵敏度低于 ELISA。例如，蛋白质印迹通常要求 PAGE 步骤在还原条件下（DTT 或 BME，然后煮沸）和高浓度 SDS 去污剂存在下进行。这些程序组件实际上可能会变性或阻断一些可在 ELISA 中检测到的天然 HCP 表位。蛋白质从 PAGE 转移到膜上的不完全转移以及膜上抗原位点或抗原位点附近的吸附也会限制蛋白质印迹观察到的结合量。
当您尝试提高蛋白质印迹的灵敏度，但该方法的特异性也很常见。通常看到的是，以非常高浓度存在的非免疫反应性蛋白质（例如您的药物物质）总是会非特异性地吸附一些过量的抗 HCP 抗体，从而导致错误的结论，即抗 HCP 抗体似乎\"与您的产品发生交叉反应”。确认与您的产品的这种非特异性结合的方法是使用与抗 HCP 抗体相同种类和相同浓度的非免疫免疫球蛋白。如果药物物质带的强度与正常山羊 IgG 和抗 HCP 抗体相同，则可以断定该带是非特异性的。还可以通过加载 1-4 纳克/泳道范围内更少量的原料药来确认特异性。如果存在真正的交叉反应抗体，可能表现为假 HCP 水平，您仍然应该看到很强的产物条带。是除了这些实验之外，应当理解，ELISA 方法的特异性通常比蛋白质印迹好几个数量级，这在很大程度上归因于任何蛋白质必须同时被捕获抗体和检测抗体结合。因此，Western blot 中的大多数人为产物条带在 ELISA 方法中不会产生明显的 HCP 活性。
虽然 Western blot 对于检测除非常上游样品之外的所有样品中的 HCP 没有什么价值，但它一直在不断地发展。用于证明 ELISA 试剂盒中的抗体与细胞系中的大多数 HCP 发生反应。这通常是一项一次性实验，您可以裂解一些细胞或在蛋白质印迹中使用细胞系的条件培养基，并将印迹与来自 PAGE 的蛋白质染色（例如胶体金或银染色）进行比较。如果同源性足够，则可以得出结论，该抗体在 ELISA 试剂盒中具有足够的反应性，尽管这只是通过验证ELISA 的结果可以得出抗体是足够的结论。
为什么稀释线性很重要？稀释线性是一项关键的鉴定实验，应在所有下游样品上进行需要 HCP 杂质数据。该实验涉及使用经批准的测定稀释剂进行一系列双倍稀释，以获得测定分析范围内的 HCP 浓度。然后分析这些稀释液，并确定每次稀释液的稀释校正杂质浓度。该稀释线性研究确定了样品基质干扰的自由度，并且还证明了样品中杂质阵列的抗体过量的重要条件。请参阅\"钩状效应：什么是\"高剂量钩状效应”？”部分在我们的常见问题解答中。稀释线性分析应该是您执行的第一个鉴定实验之一，以确定测定精度是否符合目的。这对于HCP 测定是因为某些单独的 HCP 浓度非常高，可能会接近针对该特定 HCP 的抗体的饱和度。发生这种情况时，该 HCP 存在严重定量不足的风险。通过进行稀释分析，可以验证抗体是否过量以及样品基质本身是否不会干扰。如果抗体处于限制浓度或样品基质引起负干扰，将观察到样品的表观 HCP 浓度随着稀释度的增加而增加。
在大多数情况下，将达到稀释度，其中稀释校正值基本保持恒定。我们将其称为最低所需稀释度 (MRD)。下表显示了示例数据，其中样品在高浓度下未产生良好的稀释线性，但通过进一步稀释，确定了获得可接受稀释线性的 MRD。在此示例中，我们得出结论，此进程内 sa 的 MRDmple 为 1:8，报告的 HCP 浓度为 361ng/mL。一旦为特定样品类型建立了 MRD，您的 SOP 应反映出这些样品在检测前需要稀释。我们建议将可接受的稀释线性定义为稀释校正的分析物浓度，在双倍稀释之间变化不超过 80% 至 120%。由于测定范围低端的统计限制，您应避免考虑稀释数据，其中稀释校正前的测定值接近测定的 LOQ。可接受的稀释剂可能因检测而异，我们鼓励您向 Cygnus Technologies 验证您的样品稀释剂是否可接受。
一般来说，最好的稀释剂与用于制备试剂盒标准品的稀释剂相同。可以从 Cygnus 购买 100ml、500ml 或 1000mL 瓶装的检测专用稀释剂。请联系 Cygnus 了解有关可接受稀释剂的信息。如果您确定有重要的产品或垫子rix 干扰和简单稀释不是一种选择，我们鼓励您联系技术服务部门，获取有关如何最好地解决样品准确性问题的建议。通过分析您的数据，我们经验丰富的员工可以提供最佳解决方案，其中可能涉及修改检测方案、检测前的样品处理、改进您的纯化过程或开发更具流程特异性的检测。
稀释线性数据示例如下所示：
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